PCR仪是个什么仪器

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PCR仪是个什么仪器

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶*的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

PCR仪的使用方法

方法：

1、将DNA加热（至90~95℃）变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板。

2、则是令 Primers于一定的温度下（冷却至55~60℃）附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加热至70~75℃）进行引物的延长 Extension of primers及另一股的合成。

标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。

根据PCR退火温度和扩增条件（细胞内/外），标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

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1、普通PCR仪：一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的、对单一退火温度的目的基因的扩增。主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。

2、梯度PCR仪：普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)。由于被扩增的DNA片段不同，其最佳退火温度也不同，通过梯度设置。

可一次性筛选出最佳的退火温度。这样既可节省试验时间，提高实验效率，又能节约实验成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。

3、原位PCR仪：是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。

细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物、DNA聚合酶、核苷酸等均可进进细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。

原位PCR仪对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重要意义。

参考资料来源：百度百科-PCR仪

定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？

开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板 上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。

关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。

原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。

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主要操作流程：

1、针对目的基因序列选择合适的扩增片断，设计引物。DNA引物长度：15-25 个碱基GC含量：50%左右如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交。

倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的△G为负值，即：<10 kcal/mol.没有连续的G/C。引物探针的保存一般遵循以下原则：正向和反向引物保存在-20度，浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。

2、输入靶序列，用进行比对；

3、检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计；

4、在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度；

5、考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。

最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染；

6、在RT步骤时，用工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低。

参考资料来源：百度百科-实时荧光定量pcr仪

参考资料来源：百度百科-定量PCR

进口PCR仪与国产PCR仪的区别在于哪里

1、仪器性能：进口PCR以，和国产的PCR仪，在技术和使用性能上基本上没有多大的差别，比如：升降温速率，孔间温差，温度均一性，梯度温度范围，热盖温度等性能指标，国内外仪器基本达到了相同水平。而其差别主要是在功能上的差别，价格确实相差几倍。
2、仪器功能：进口和国产仪器主要功能：如保存，过温保护，断电保护，热盖功能等基本上是一样的，只是附带功能上有所差别，比如：进口的显示屏是大型的触摸式荧屏操作，国产的大多是触摸键，荧屏显示操作，进口仪器有的可以升级为荧光定量PCR仪，而国产的目前主要是专用机。而这些仪器附带功能的差别大多都是最近两年新推出来的，价格确是相差几倍。有的进口仪器没有这些附带的特殊功能，从性能和功能上比有的等于或低于国产的。

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